2325

آئين كاربرد روشهاي عمومي آزمايشهاي ميكروبي مواد غذائي

چاپ هفتم

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران تنها سازماني است در ايران كه بر طبق قانون ميتواند استاندارد رسمي فرآوردهها را تعيين و تدوين و اجراي آنها را با كسب موافقت شورايعالي استاندارد اجباري اعلام نمايد. وظايف و هدفهاي موسسه عبارتست از:

(تعيين، تدوين و نشر استانداردهاي ملي – انجام تحقيقات بمنظور تدوين استاندارد بالا بردن كيفيت كالاهاي داخلي، كمك به بهبود روشهاي توليد و افزايش كارائي صنايع در جهت خودكفائي كشور - ترويج استانداردهاي ملي – نظارت بر اجراي استانداردهاي اجباري – كنترل كيفي كالاهاي صادراتي مشمول استانداردهاي اجباري و جلوگيري از صدور كالاهاي نامرغوب بمنظور فراهم نمودن امكانات رقابت با كالاهاي مشابه خارجي و حفظ بازارهاي بين المللي كنترل كيفي كالاهاي وارداتي مشمول استاندارد اجباري بمنظور حمايت از مصرف كنندگان و توليدكنندگان داخلي و جلوگيري از ورود كالاهاي نامرغوب خارجي راهنمائي علمي و فني توليدكنندگان، توزيع كنندگان و مصرف كنندگان – مطالعه و تحقيق درباره روشهاي توليد، نگهداري، بسته بندي و ترابري كالاهاي مختلف – ترويج سيستم متريك و كاليبراسيون وسايل سنجش – آزمايش و تطبيق نمونه كالاها با استانداردهاي مربوط، اعلام مشخصات و اظهارنظر مقايسه اي و صدور گواهينامه هاي لازم).

موسسه استاندارد از اعضاء سازمان بين المللي استاندارد ميباشد و لذا در اجراي وظايف خود هم از آخرين پيشرفتهاي علمي و فني و صنعتي جهان استفاده مينمايد و هم شرايط كلي و نيازمنديهاي خاص كشور را مورد توجه قرار ميدهد.

اجراي استانداردهاي ملي ايران بنفع تمام مردم و اقتصاد كشور است و باعث افزايش صادرات و فروش داخلي و تأمين ايمني و بهداشت مصرف كنندگان و صرفه جوئي در وقت و هزينهها و در نتيجه موجب افزايش درآمد ملي و رفاه عمومي و كاهش قيمتها ميشود.

تهيه كننده كميسيون فني استاندارد ميكروبيولوژي مواد غذايي
رئيس
آزمايشگاه كنترل غذا و دارو ( وزارت بهداري )	دكتر در ميكروبيولوژي مواد غذائي	بزرگمهر - وزيري
اعضاء
مركز بازرسي و كنترل بهداشتي مواد غذائي ارتش جمهوري اسلامي ايران	دكتر دامپزشك	اكبري - علي اصغر
كارشناس انستيتو تغذيه و صنايع غذائي		اعتمادي - فتانه
سازمان صنايع شير پاستوريزه	ليسانس صنايع غذائي	تعاوني - گيتي
آزمايشگاه مواد غذائي مؤسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران	ليسانس بيولوژي	دادفرما - فرشته
دانشكده بهداشت ـ دانشگاه تهران	دكتراي علوم و بيوشيمي	كشاورز دهنو - علي
آزمايشگاه مواد غذائي بهداري استان مركز	دكتر در كشاورزي	رفوگران - علينقي
دانشيار دانشكده كشاورزي	دكتر در ميكروبيولوژي مواد غذائي	لامع - حسن
اداره نظارت بر مواد خوراكي و آشاميدني	مهندس كشاورزي	مجرد - كامران
آزمايشگاه كنترل غذا و دارو ( وزارت بهداري )	دكتر دامپزشك	صدر زاده - پرويز
دبير
كارشناس مؤسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران	فوق ليسانس بيولوژي	حق شناس - فريده

فهرست مطالب

آئين كاربرد روشهاي عمومي آزمايشهاي ميكربي مواد غذائي

هدف

وسايل معمول در آزمايشگاه ميكربي

كشت ميكروارگانيسمها

محيطهاي كشت

روش كشت

روشهاي سترون كردن

مشخصات شكلي ميكروارگانيسمها و ويژگي ظاهري پرگنهها

آماده كردن گسترههاي ميكربي

رنگ آميزي

آزمايشهاي بيو شيميايي

حركت

پيوست

معرف باريتر

معرف گريس ايلوسواي

معرف ارليخ

محيط سيم

بسمه تعالي

پيشگفتار

استاندارد آئين كاربرد روشهاي عمومي آزمايشهاي ميكربي مواد غذايي كه به وسيله كميسيون فني ميكرو بيولوژي مواد غذائي تهيه و تدوين شده و در كميته نهائي صنايع فوق مورد تأييد قرار گرفته و در بيست و نهمين جلسه كميته ملي صنايع غذائي مورخ 60/8/18 تصويب گرديد . پس از تأييد شوراي عالي استاندارد و به استناد ماده يك ( قانون مواد الحاقي به قانون تأسيس مؤسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران مصوب آذر ماه 1349) به عنوان استاندارد رسمي ايران منتشر ميگردد .

براي حفظ همگامي و هماهنگي با پيشرفتهاي ملي و جهاني صنايع و علوم استانداردهاي ايران در مواقع لزوم يا در فواصل معين مورد تجديد نظر قرار خواهند گرفت و هر گونه پيشنهادي كه براي اصلاح يا تكميل اين استانداردها برسد در هنگام تجديد نظر در كميسيون فني مربوط مورد توجه واقع خواهد شد .

بنابراين براي مراجعه به استانداردهاي ايران بايد همواره از آخرين چاپ و تجديد نظر آنها استفاده نمود .

در تهيه اين استاندارد سعي بر آن بوده است كه با توجه به نيازمنديهاي خاص ايران حتيالمقدور ميان روشهاي معمول در اين كشور و استاندارد و روشهاي متداول در كشورهاي ديگر هماهنگي ايجاد شود .

لذا با بررسي امكانات و مهارتهاي موجود و اجراي آزمايشهاي لازم استاندارد حاضر با استفاده از منابع زير تهيه گرديد :

1) B.B.L manual of products and laboratory procedures (1972) fifth Ed.

2) Harrigan W. F. / M. E. Mc. Cane
laboratory methods in food and dairy microbiology academic press (1976)

3) The international commission on microbiological specification for foods (ICMSF)
micro – organism in foods
university of Torento press (1978)

آئين كاربرد روشهاي عمومي آزمايشهاي ميكربي مواد غذائي

1 ـ هدف

هدف از تدوين اين استاندارد , ارائه اطلاعات اساسي است كه در آزمايشگاههاي ميكربي مواد غذائي مورد استفاده ميباشد و شامل وسايل مورد لزوم روشهاي كشت ـ محيطها مشخصات شكلي ميكروارگانيسمها ـ ويژگيهاي پرگنهها ( كلنيها ) و آزمايشهاي متداول بيوشيميايي است .

2 ـ وسايل معمول در آزمايشگاه ميكربي

2 ـ 1 ـ دستگاهها

2 ـ 1 ـ 1 ـ اتوكلاو

2 ـ 1 ـ 2 ـ بهمزن ¹ ـ بهمزن با دور كم براي مخلوط كردن نمونه

2 ـ 1 ـ 3 ـ ترازو ـ به ظرفيت حداقل 2500 گرم و حساسيت يك دهم گرم

2 ـ 1 ـ 4 ـ حمام آب ( بن ماري )

2 ـ 1 ـ 5 ـ فور قابل تنظيم تا 200 درجه سلسيوس يا بيشتر براي سترون كردن وسايل شيشهاي با حرارت خشك .

2 ـ 1 ـ 6 ـ گرمخانه ( اتو ) قابل تنظيم در حرارتهاي 25 الي 55 درجه سلسيوس

2 ـ 1 ـ 7 ـ مخلوط كن الكتريكي ـ با سرعت قابل تنظيم با مخزن در دار كه جنس آن از فلز زنگ نزن و يا مواد ديگر مقاوم به حرارت اتوكلاو بوده , ضمنأ در آن به طوري محكم بسته شود كه از پخش شدن نمونه به اطراف جلوگيري گردد .

2 ـ 1 ـ 8 ـ ميكروسكوپ

2 ـ 2 ـ ساير وسايل

2 ـ 2 ـ 1 ـ استوانههاي مدرج شيشهاي ( مزور ) بالن ژوژه ـ ارلن ماير به حجمهاي مختلف .

2 ـ 2 ـ 2 ـ پنبه يا درپوشهاي اسفنجي و غيره .

2 ـ 2 ـ 3 ـ پي پتهاي مدرج پيپت پاستور

2 ـ 2 ـ 4 ـ ظرفهاي پتري ( پليت ) به ارتفاع 15 و قطر 100 ميليمتر از جنس شيشه يا پلي اتيلن

2 ـ 2 ـ 5 ـ سوزن كشت يا سوزن كشت با نوك حلقهاي كه بهترست از جنس پلاتين ايريديوم يا نيكروم باشد .

2 ـ 2 ـ 6 ـ قوطيهاي استوانهاي شكل جهت سترون كردن پي پتها و ظرفهاي پتري

2 ـ 2 ـ 7 ـ لام و لامل

2 ـ 2 ـ 8 ـ لولههاي آزمايش به ابعاد مختلف ـ جا لولهاي ـ سبد

2 ـ 2 ـ 9 ـ لولههاي مخصوص نمونه برداري از قالبهاي پنير و كره يا چوب پنبه سوراخ كن

2 ـ 2 ـ 10 ـ ميله پخش كننده شيشهاي به فرم L جهت گستراندن نمونه روي محيط

2 ـ 2 ـ 11 ـ ساير وسايل از قبيل چاقو ـ چنگال ـ قيچي ـ گيره و قطره چكان ـ سوآب و غيره جهت آماده كردن نمونه .

3 ـ كشت ميكروارگانيسمها

ميكروارگانيسمها را ميتوان بر روي محيطها و در ظروف گوناگون كشت داد . تركيب محيط كشت بايد به گونهاي باشد كه مواد لازم براي رشد ميكروارگانيسمها را در برداشته باشد .

شكل ظروفي كه براي كشت به كار ميروند بستگي به نوع كشت دارد . اين ظروف ميتواند لولههاي آزمايش ـ ارلن ماير و ظروفهاي پتري و يا لولههاي مخصوص در دار باشد . سر لولههاي آزمايش و ارلن ماير معمولا با پنبه و يا درپوشهاي ابر مانند پوشانده ميشوند . يكي از مزيتهاي لولههاي سر پيچدار اينست كه از تبخير آب موجود در محيط كشت جلوگيري ميكند .

4 ـ محيطهاي كشت

محيطهاي كشت را متناسب با نوع آزمايش ميتوان به دو صورت مايع و جامد تهيه كرد .

4 ـ 1 ـ محيط كشت مايع ²:

محيطهاي مايع به علت نداشتن آگارد در تركيب خود به صورت جامد در نيامده و متناسب با نوع ميكروارگانيسم و آزمايشهاي مورد نظر ميتوان آنها را در لولههاي آزمايش ـ ارلن ماير و يا ظروف ديگر مورد استفاده قرار داد .

4 ـ 2 ـ محيط كشت جامد ³:

محيطهاي جامد به علت دارا بودن آگار در تركيب خود به صورت جامد بوده و متناسب با ميكروارگانيسمها و آزمايشهاي مورد نظر ميتوان آنها را در لوله ظروف پتري و يا ظروف ديگر مورد استفاده قرار داد .

4 ـ 2 ـ 1 ـ كشتهاي جامد در لوله را ميتوان به صورتهاي زير تهيه كرد .

4 ـ 2 ـ 1 ـ 1 ـ كشتهاي عمقي ( عمودي ) ⁴ ـ حدود 5 الي 10 ميلي ليتر از محيط كشت را در لوله آزمايش ريخته و به طور عمودي ميگذارند تا محيط بسته شود .

سپس ميكروارگانيسمها را توسط سوزن كشت به طور عمقي در مركز اين محيط كشت ميدهند .

4 ـ 2 ـ 1 ـ 2 ـ كشت در داخل محيط جامد ⁵ ـ به لولههاي آزمايش محتوي محيط كشت جامد پس از ذوب شدن كه تا 45 درجه سلسيوس سرد شده است . باكتري مورد نظر را افزوده و لوله را بين دستها تكان ميدهند تا باكتريها كاملا با محيط كشت مخلوط شوند , سپس لوله آزمايش را به طور عمودي قرار ميدهند تا محيط بسته شود .

4 ـ 2 ـ 1 ـ 3 ـ كشت شيب دار ⁶ ـ حدود 5 ميلي ليتر از محيط كشت جامد ( ذوب شده ) در لوله آزمايش و يا لولههاي كوچك ديگر ريخته ميشود و پس از سترون كردن آنها را به صورت كج به گونهاي ميخوابانند كه سطح محيط كشت شيب دار باشد .

ميكروارگانيسمها را با سوزن كشت در عمق و سطح و يا به وسيله سوزن كشت با نوك حلقهاي ( لوپ ) در سطح شيب دار كشت ميدهند .

4 ـ 2 ـ 2 ـ كشت جامد در ظرف پتري ـ كه به سه صورت انجام ميگيرد :

4 ـ 2 ـ 2 ـ 1 ـ كشت خطي در سطح محيطهاي جامد در ظرف پتري ـ با اين روش ميتوان ميكروارگانيسم را به طور خطي توسط سوزن كشت نوك حلقهاي ( لوپ ) در سطح محيط جامد كشت داد .

4 ـ 2 ـ 2 ـ 2 ـ كشت در سطح محيط ـ در اين روش توسط پي پت مقدار مشخص از رفت معيني از ميكروارگانيسم را در سطح محيط جامد ريخته و توسط ميله پخش كننده , كاملا در سطح محيط ميگسترانند .

4 ـ 2 ـ 2 ـ 3 ـ كشتهاي دو لايه ـ در اين روش كشت مايع باكتري ( سوسپانسيون باكتري ) به محيط كشت ذوب شده ( حرارت 45 درجه سلسيوس ) افزوده ميشود . در صورت لزوم باكتري را با لايه نازكي از همان محيط كشت ميپوشانند و پس از بسته شدن محيط ظرفهاي پتري را به طور واژگون در گرمخانه قرار ميدهند تا از ريختن قطرات آب در سطح محيط جلوگيري گردد .

4 ـ 2 ـ 3 ـ انواع محيطهاي كشت ـ محيطهاي كشت را از نظر تركيب شيميايي و دارا بودن مواد غذائي يا مواد باز دارنده ميتوان به چند دسته تقسيم كرد .

4 ـ 2 ـ 3 ـ 1 ـ محيط كشت انتخابي ⁷

اين محيطها براي جدا كردن يك يا دستهاي از ميكروارگانيسمها به كار ميروند و به علت دارا بودن مواد باز دارنده , از رشد ميكروارگانيسمهاي ناخواسته جلوگيري ميكنند مانند محيط بردباركر جهت جدا كردن استافيلوكوكوس اورئوس و يا محيط S.S براي سالمونلا و شيگلاو يا محيط داراي نمكهاي صفراوي براي جدا كردن كلي فرمها .

4 ـ 2 ـ 3 ـ 2 ـ محيطهاي كشت غني كننده ⁸

اين محيطها معمولا در مواردي به كار ميروند كه تعداد ميكروارگانيسم مورد جستجو در نمونه غذائي كم بوده و يا به علت وجود زياد ميكروارگانيسمهاي ديگر جدا كردن آن با اشكال مواجه است . اين محيطها با تركيب خاص خود از نظر pH و مواد غذائي امكان رشد براي ميكروارگانيسم مورد نظر را فراهم ميكند , مانند محيط گوشت پخته براي جدا كردن استافيلوكوكوس اورئوس .

4 ـ 2 ـ 3 ـ 3 ـ محيطهاي كشت افتراتي ( جدا كننده ) ⁹

محيطهايي هستند كه ميكروارگانيسمهاي مختلف در آن ويژگيهاي خاص خود را نشان ميدهند , مانند محيطهاي خون دار كه در آن نمونههاي هموليتيك و غير هموليتيك از هم جدا ميشوند . و محيط مك كانكي آگار كه در آن كلي فرمهاي تخمير كننده لاكتوز پرگنههاي قرمز ميدهند . در حالي كه باكتريهاي رودهاي كه قادر به تخمير لاكتوز نيستند مانند سالمونلا پرگنههاي بي رنگ به وجود ميآورند .

5 ـ روش كشت

در موقع كشت دادن بايد از آلوده شدن كشتها به شدت جلوگيري گردد براي كشت بايد روش ستروني ¹⁰ را به كار برد . انتقال ميكروارگانيسم از محيطي به محيط ديگر معمولا با سوزن كشت و يا پي پت سترون انجام ميگيرد . سوزن كشت را بايد طوري روي شعله گرفت ¹¹ تا سرخ رنگ شود پس از سرخ شدن سوزن كشت بايد چند ثانيه صبر كرد تا سوزن سرد گردد . زيرا در غير اين صورت دماي زياد ميكروارگانيسمها را خواهد كشت در پوش لوله آزمايش محتوي ميكروارگانيسم را توسط انگشت كوچك و كف دست باز كرده و تا پايان كشت آن را در همين حالت نگاه داشت ( هرگز نبايد در پوش را روي ميز گذارد ) دهانه لوله آزمايش را بايد در جلوي شعله نگاهداشته و برداشت ميكرب بايد در نزديكي شعله انجام گيرد . پس از برداشت دهانه لوله آزمايش را كمي حرارت داده و درپوش آنرا گذاشته و سپس ميكروارگانيسم را با رعايت شرايط ستروني به محيط ديگر انتقال داد .

پس از پايان كشت , سوزن دوباره روي شعله سترون ميگردد .

يادآوري 1 گرم كردن سوزن بايد تدريجي باشد . زيرا دماي زياد باعث پاشيده شدن ميكروارگانيسمها به اطراف و احتمالا سر و صورت آزمايش كننده ميگردد .

يادآوري 2 در كليه موارد به منظور اطمينان از روش كشت , به كار بردن محيط شاهد فاقد نمونه , توصيه ميشود .

6 ـ روشهاي سترون كردن

سترون كردن وسايل و محيطهاي كشت ميتواند متناسب با نوع وسيله و محيط كشت به يكي از روشهاي زير انجام شود .

6 ـ 1 ـ سترون كردن توسط حرارت خشك

لوازمي مانند سوزن كشت ـ پي پت پاستور و غيره را ميتوان روي شعله سترون كرد . ولي وسايل شيشهاي مانند ظرفهاي پتري ـ پي پتها ـ لولههاي آزمايش ـ پنس و غيره بايد در كوره سترون شوند . حرارت فور معمولا حدود 170 درجه سلسيوس و يا بيشتر ميباشد . وسايل بايد به مدت يك ساعت و نيم الي دو ساعت در اين حرارت قرار گيرند . بهتر است از نوار چسبهاي مصرف جهت نشان دادن سترون شدن استفاده گردد و در صورت نبودن نوارهاي مصرف , زرد رنگ شدن پنبه و كاغذ سفيد نشانه خوبي براي سترون شدن آنها ميباشد .

6 ـ 2 ـ سترون كردن توسط حرارت مرطوب ( اتو كلاو )

اين روش براي سترون كردن محيطهاي كشت و وسايلي كه نسبت به حرارت خشك حساس هستند به كار ميرود . معمولا زمان لازم براي سترون كردن بيشتر محيطها و وسايل , 15 دقيقه در 121 درجه سلسيوس ميباشد (15 دقيقه در 15 پوند فشار بر اينچ مربع ميباشد .)

6 ـ 3 ـ سترون كردن با گرماي متناوب ( تنداليزه كردن )

اين روش براي سترون كردن محيطهايي به كار ميرود كه حرارتهاي بالا باعث خرابي آنها ميشود . در اين روش محيط كشت را معمولا يك الي دو ساعت در حرارت 70 تا 80 درجه سلسيوس قرار ميدهند . سپس اين عمل را براي دو روز ديگر تكرار ميكنند ( جمعأ سه روز متوالي اين عمل را انجم ميدهند ) مدت و دما متناسب با نوع كشت متفاوت ميباشد .

6 ـ 4 ـ سترون كردن با استفاده از صافيهاي باكتريولژيك

صافيهاي باكتريولژيك , صافيهايي هستند كه براي سترون كردن محيطهاي كشتي كه به علت دارا بودن بعضي از مواد مانند آنتي بيوتيكها قندها يا آنزيمها نسبت به حرارت حساساند به كار ميروند . اين صافيها براي جدا كردن و شمارش ميكروارگانيسمها در مايعات نيز به كار ميروند .

( مراجعه به استاندارد روشهاي آماده كردن نمونههاي غذائي و شمارش ميكروارگانيسمها ) صافيهاي باكتريولژيك به دو دسته زير تقسيم ميشوند .

6 ـ 4 ـ 1 ـ صافيهاي چيني و سفالي ـ اين صافيها امروزه به علت دشوار بودن كاربرد و سترون كردن بعدي كمتر مورد استفاده قرار ميگيرند و مهمترين آنها عبارتند از صافيهاي شامبرلان بركفلد و ماندلر .

6 ـ 4 ـ 2 ـ صافيهاي غشائي از جنس استات سلولز ـ اين صافيها از نظر قطر منافذ به چند دسته تقسيم ميشوند . معمولترين صافيهايي كه براي كارهاي باكتريولژيك به كار ميروند داراي منافذي به قطر 0/43 تا يك ميكرون ميباشند . ¹²

7 ـ مشخصات شكلي ميكروارگانيسمها و ويژگي ظاهري پرگنهها

7 ـ 1 ـ مشخصات ميكروارگانيسمها :

براي شناسائي ميكروارگانيسمها دانستن ويژگيهاي زير ضروري است .

7 ـ 1 ـ 1 ـ حركت

7 ـ 1 ـ 2 ـ شكل , اندازه و چگونگي قرار گرفتن سلول ميكروارگانيسمها نسبت به يكديگر

7 ـ 1 ـ 3 ـ واكنش گرم ( مثبت يا منفي )

7 ـ 1 ـ 4 ـ بودن يا نبودن آندسپور ـ كپسول ـ تاژك

7 ـ 1 ـ 5 ـ واكنش زيل نلسن و رنگ آميزي اختصاصي ديگر ( در صورت لزوم )

7 ـ 2 ـ ويژگيهاي ظاهري پرگنه :

7 ـ 2 ـ 1 ـ در محيطهاي جامد

7 ـ 2 ـ 1 ـ 1 ـ شكل : گرد ¹³ نامنظم ¹⁴, و يا رشتهاي ¹⁵ ( طبق شكل شماره يك در آخر استاندارد .)

7 ـ 2 ـ 1 ـ 2 ـ اندازه : قطر پرگنه برحسب ميليمتر اندازهگيري ميشود . پرگنههايي كه قطرشان كمتر از يك ميليمتر ميباشد نقطهاي مينامند .

7 ـ 2 ـ 1 ـ 3 ـ رنگ : رنگ پرگنه و آيا رنگيزه موجود در آب محلول است و يا نامحلول

7 ـ 2 ـ 1 ـ 4 ـ تيرگي : آيا شفاف است يا كدر

7 ـ 2 ـ 1 ـ 5 ـ برجستگي : ( طبق شكل 2 آخر استاندارد .)

7 ـ 2 ـ 1 ـ 6 ـ سطح : آيا سطح پرگنه صاف است يا خشن , كدر است و يا براق

7 ـ 2 ـ 1 ـ 7 ـ لبه : ( طبق شكل شماره 3 آخر استاندارد .)

7 ـ 2 ـ 1 ـ 8 ـ قوام : آيا پرگنه به آساني با آب آميخته ميشود ? اگر آميخته ميشود آيا محلول يكنواختي به دست ميآيد و يا آن كه به صورت دانه دانه است .

7 ـ 2 ـ 1 ـ 9 ـ بو : آيا پرگنه بودار است و يا بدون بو

7 ـ 2 ـ 2 ـ در محيطهاي مايع :

7 ـ 2 ـ 2 ـ 1 ـ مقدار رشد : ( هيچ ـ كم ـ متوسط ـ زياد )

7 ـ 2 ـ 2 ـ 2 ـ پرده در سطح محيط مايع

الف : پرده يا پوستهاي وجود ندارد

ب : پرده يا پوسته سطح وجود دارد كه اين پوسته ممكنست با تكان دادن پاره شود يا نشود .

7 ـ 2 ـ 2 ـ 3 ـ كدورت : كدورت يكنواخت و يكسان و كدورت غير يكنواخت

7 ـ 2 ـ 2 ـ 4 ـ ته نشست

الف : ته نشت وجود ندارد

ب : ته نشست وجود دارد كه در اين صورت يا با تكان دادن متلاشي ميشود و يا نميشود .

8 ـ آماده كردن گسترههاي ميكربي

براي تهيه گسترههاي ميكربي از كشتهاي جامد به شرح زير عمل شود .

1 ـ يك قطره آب يا سرم فيزيولژي را توسط سوزن كشت بر روي لام تميز ( شسته شده با الكل ) قرار دهيد .

2 ـ سوزن كشت را روي شعله سترون كنيد .

3 ـ پس از سرد شدن سوزن كشت , آن را به طور كج در دست گرفته و كمي از پرگنه باكتري را توسط آن برداريد .

4 ـ برداشته ميكربي را روي لام انتقال داده و با چرخش سوزن آن را به طور يكنواخت روي لام پخش كنيد , چنانچه برداشته ميكربي روي لام به صورت گلوله درآمد نشانه چرب بودن لام است كه بايد تميز شود .

5 ـ سوزن كشت را روي شعله مجددا سترون كنيد .

6 ـ لام را به آرامي در حرارت اطاق خشك كرده و پس از خشك كردن لام را دو سه بار به تندي از روي شعله بگذرانيد ( اين كار سبب ثابت شدن باكتريهاي روي لام ميشود ) تهيه گستره ميكربي از محيطهاي

كشت مايع : شبيه روش بالا است با اين تفاوت كه نيازي به قطره آب نداشته و مستقيمأ ميتوانيد آن را روي لام قرار دهيد .

9 ـ رنگ آميزي

9 ـ 1 ـ رنگ آميزي ساده

در اين رنگ آميزي لامهاي ثابت شده به روش فوق , فقط با يك رنگ , رنگ آميزي ميگردند .

9 ـ 1 ـ 1 ـ بنفش كريستال ¹⁶

با محلول 0/5 درصد بنفش كريستال در آب به مدت يك دقيقه لام را رنگ آميزي كنيد .

9 ـ 1 ـ 2 ـ آبي متيلن ( بلودومتيلن ) ¹⁷ لوظر

طرز تهيه محلول :

1 ميلي ليتر	محلول يك درصد پتاس
30 ميلي ليتر	محلول اشباع شده آبي متيلن در الكل
100 ميلي ليتر	آب مقطر

مواد فوق را با يكديگر مخلوط كرده , سپس به مدت چهار دقيقه با آن لام را رنگ آميزي كنيد .

9 ـ 1 ـ 3 ـ محلول فوشين ( رقيق )

با محلول فوشين رقيق بند 9 ـ 2 ـ 2 ـ 3 لام را مدت 30 ثانيه رنگ آميزي كنيد .

9 ـ 2 ـ رنگ آميزي گرم ¹⁸

اين رنگ آميزي جهت تشخيص و شناسائي باكتريها داراي اهميت ويژهاي است , بر پايه اين رنگ آميزي باكتريها به دو دسته تقسيم ميشوند .

باكتريهاي گرم مثبت كه در نتيجه شست و شوي آنها با الكل رنگ بنفش كريستال پاك نميشود . از اين رو اين دسته از باكتريها به رنگ بنفش در ميآيند مانند انواع باسيلوسها و كوكوسهاي گرم مثبت . در باكتريهاي گرم منفي به علت اختلاف ساختمان ديوارهاي اين باكتريها با باكتريهاي گرم مثبت , در نتيجه شست و شوي با الكل رنگ بنفش كريستال پاك ميگردد و باكتريها رنگ فوشين را به خود ميگيرند از اين رو به رنگ صورتي در ميآيند . مانند پزدوموناس واشريشيا

يادآوري اين رنگ آميزي بايد روي كشتهاي جوان 18 الي 24 ساعته انجام شود . زيرا واكنش رنگي پارهاي از باكتريها در كشتهاي كهنه دگرگون ميشود .

9 ـ 2 ـ 1 ـ روش رنگ آميزي

9 ـ 2 ـ 1 ـ 1 ـ گستره ميكربي را از كشت جوان 18 الي 24 ساعته تهيه كنيد .

9 ـ 2 ـ 1 ـ 2 ـ با بنفش كريستال به مدت يك الي دو دقيقه رنگ آميزي كنيد .

9 ـ 2 ـ 1 ـ 3 ـ با آب مقطر بشوئيد .

9 ـ 2 ـ 1 ـ 4 ـ محلول لوگل را بيفزائيد , بگذاريد يك تا دو دقيقه بماند .

9 ـ 2 ـ 1 ـ 5 ـ با آب مقطر شسته و آب روي لام را كاملا خالي كنيد .

9 ـ 2 ـ 1 ـ 6 ـ لام را توسط الكل 95 درصد به مدت چند ثانيه بشوئيد .

9 ـ 2 ـ 1 ـ 7 ـ با آب مقطر بشوئيد .

9 ـ 2 ـ 1 ـ 8 ـ با محلول فوشين رقيق به مدت 10 تا 30 ثانيه رنگ آميزي كنيد .

9 ـ 2 ـ 1 ـ 9 ـ با آب مقطر شسته و بگذاريد تا لام خشك شود .

9 ـ 2 ـ 2 ـ طرز تهيه محلولهاي رنگ آميزي گرم

9 ـ 2 ـ 2 ـ 1 ـ محلول بنفش كريستال

0/5 گرم	بنفش كريستال
100 ميلي ليتر	آب مقطر

9 ـ 2 ـ 2 ـ 2 ـ محلول لوگل

1 گرم	يد
2 گرم	يدور پتاسيم
300 ميلي ليتر	آب مقطر

9 ـ 2 ـ 2 ـ 3 ـ محلول فوشين رقيق

10 ميلي ليتر	فوشين زيل نلسن بند 9 ـ 2 ـ 3 ـ
150 ميلي ليتر	آب مقطر

9 ـ 3 ـ رنگ آميزي زيل نلسن ¹⁹

اين رنگ آميزي جهت باكتريهاي مقاوم به اسيد و الكل ( باكتريها جنس ميكوباكتريوم ) ميباشد كه اين باكتريها با رنگ آميزي ساده و گرم رنگ نپذيرفته و يا بسيار كم رنگ ميپذيرند .

9 ـ 3 ـ 1 ـ روش رنگ آميزي

9 ـ 3 ـ 1 ـ 1 ـ گستره ميكربي را طبق بند 8 تهيه كنيد .

9 ـ 3 ـ 1 ـ 2 ـ لام را با فوشين زيل نلسن بند 9 ـ 3 ـ 2 ـ كاملا پوشانيده , سپس توسط سو آب آغشته به الكل زير لام را حرارت دهيد . به محض اين كه بخار از روي لام بلند شد حرارت دادن را قطع كنيد ( در صورت لزوم مقدار كافي فوشين به لام افزوده و به مدت 5 دقيقه ديگر بدون اين كه بجوشد حرارت را ادامه دهيد .)

9 ـ 3 ـ 1 ـ 3 ـ لام را توسط اسيد سولفوريك 20 درصد شسته تا رنگ اضافي آن پاك گردد ( در اين حال گستره ميكربي به رنگ قهوهاي در ميآيد .) آنقدر لام را با آب بشوئيد تا گستره ميكربي به رنگ صورتي در آيد . مجددا لام را با اسيد و سپس با آب مقطر بشوئيد . اين عمل را چند بار تكرار كنيد تا گستره ميكربي صورتي كمرنگ گردد .

9 ـ 3 ـ 1 ـ 4 ـ لام را كاملا با آب بشوئيد .

9 ـ 3 ـ 1 ـ 5 ـ لام را به مدت 5 دقيقه با آبي متيل رنگ آميزي كنيد .

9 ـ 3 ـ 1 ـ 6 ـ لام را كاملا با آب شسته و رنگ اضافي را از پشت آن پاك و پس از خشك شدن با ميكروسكپ مطالعه كنيد .

9 ـ 3 ـ 2 ـ طرز تهيه محلول فوشين مربوط به رنگ آميزي زيل نلسن

1 گرم	فوشين بازي
10 ميلي ليتر	الكل مطلق
100 ميلي ليتر	محلول %5 فنل ( اسيد فنيك )

فوشين را در الكل حل كرده و سپس فنل بدان بيفزائيد .

9 ـ 4 ـ رنگ آميزي هاگ باكتريها

9 ـ 4 ـ 1 ـ روش كار

9 ـ 4 ـ 1 ـ 1 ـ گستره ميكربي را به روش معمولي تهيه كرده , سپس با گذراندن آن از روي شعله ( در حدود 20 بار ) پايدار كنيد .

9 ـ 4 ـ 1 ـ 2 ـ گستره را به مدت 10 دقيقه با محلول 0/5 درصد سبز مالاشيت رنگ آميزي كنيد .

9 ـ 4 ـ 1 ـ 3 ـ گستره را به آرامي با آب سرد بشوئيد (10 ثانيه )

9 ـ 4 ـ 1 ـ 4 ـ گستره را با محلول 0/5 درصد سافرانين به مدت 15 ثانيه رنگ آميزي كنيد .

9 ـ 4 ـ 1 ـ 5 ـ گستره را با آب شسته و خشك كنيد . اين نمونه براي بررسي ميكروسكپي آماده ميباشد .

9 ـ 4 ـ 2 ـ طرز تهيه سبز مالاشيت

به 0/5 گرم سبز مالاشيت آب مقطر افزوده سپس حجم آن را توسط آب مقطر به 100 ميلي ليتر برسانيد .

9 ـ 4 ـ 3 ـ طرز تهيه سافرانين

به 0/5 گرم سافرانين آب مقطر افزوده سپس حجم آن را با آب مقطر به 100 ميلي ليتر برسانيد .

10 ـ آزمايشهاي بيو شيميايي

آزمايشهاي بيو شيميايي متداول به شرح زير ميباشد .

10 ـ 1 ـ تخمير قندها ²⁰

اين آزمايش براي شناسائي ميكروارگانيسمهاي مختلف كه قادر به تخمير قندهاي خاص ميباشند به كار ميرود .

10 ـ 1 ـ 1 ـ دستور كار ـ ميكروارگانيسم مورد نظر را در تعداد زيادي از لولههاي آبگوشت حاوي قندهاي گوناگون كشت داده و مدت 48 ساعت در دماي مناسب قرار دهيد .

يادآوري ـ قند مورد استفاده و دماي مناسب براي هر ميكروارگانيسم در استاندارد روش شناسائي مخصوص آن ميكروارگانيسم شرح داده شده است .

10 ـ 2 ـ آزمايش متيل رد ²¹

اين آزمايش براي تعيين pH نهائي كه از تخمير گلوكز حاصل ميگردد انجام ميشود .

pH نهائي در باكتريهاي مختلف فرق ميكند .

10 ـ 2 ـ 1 ـ دستور كار ـ باكتري را در محيط آبگوشت ـ گلوكز فسفات به مدت 5 روز كشت دهيد و پس از اين مدت چند قطره از محلول %4 درصد متيل رد به محيط بيفزائيد .

10 ـ 2 ـ 3 ـ نتيجه آزمايش

پيدايش رنگ قرمز ـ آزمايش مثبت و 4/4Hp يا بيشتر است .

پيدايش رنگ زرد ـ آزمايش منفي و 4/4Hp يا كمتر است .

اگر رنگ حد فاصل باشد pH نيز حد فاصل در نظر گرفته ميشود .

10 ـ 3 ـ آزمايش وژپرسكوئر (VP) ²²

اين آزمايش براي تعيين وجود استيل ـ متيل ـ كاربينول به كار ميرود . اين ماده , ماده حد واسطي است كه از تخمير گلوكز به وجود ميآيد و در برخي از گونهها در محيط كشت انباشته ميشود , هنگامي كه آزمايش MR ( متيل رد ) مثبت است معمولا آزمايش مذكور منفي است و برعكس

10 ـ 3 ـ 1 ـ دستور كار ـ باكتري مورد نظر را در آبگوشت گلوكز ـ پپتن ـ فسفات كشت داده و مدت 48 ساعت در دماي مناسب قرار داده و پس از اين مدت 2 ميلي ليتر از معرف باريتز ²³ ( محلول 5 درصد آلفانفتول ) و 6 ميلي ليتر از محلول 40 درصد پتاس به محيط كشت بيفزائيد .

10 ـ 3 ـ 2 ـ نتيجه آزمايش

10 ـ 3 ـ 2 ـ 1 ـ پيدايش رنگ صورتي در مدت 10 دقيقه : آزمايش مثبت و نشانه وجود استيل متيل كاربينول در محيط ميباشد .

10 ـ 3 ـ 2 ـ 2 ـ عدم پيدايش رنگ صورتي در مدت 10 دقيقه : آزمايش منفي , نشانه عدم وجود استيل متيل كاربينول در محيط ميباشد .

10 ـ 4 ـ هيدروليز نشاسته ²⁴

اين آزمايش براي شناسائي ميكروارگانيسمهايي كه قادر به هيدروليز نشاسته هستند به كار ميرود .

10 ـ 4 ـ 1 دستور كار ـ ميكروارگانيسم مورد آزمايش را روي محيط نشاسته به طور خطي كشت داده و پس از 2 الي 4 روز گرمخانه گذاري نتيجه آزمايش را بررسي كنيد .

10 ـ 4 ـ 1 ـ 1 ـ نتيجه آزمايش

وجود هاله شفاف در اطراف پرگنه نشانه هيدروليز نشاسته و مثبت بودن آزمايش است .

10 ـ 4 ـ 1 ـ 2 ـ عدم وجود هاله شفاف در اطراف پرگنه نشان ميدهد كه نشاسته هيدروليز نشده و آزمايش منفي است .

يادآوري ـ در صورت مشكوك بودن آزمايش محيط كشت را بايد از محلول يد رقيق پر كنيد در اين صورت نقاطي كه نشاسته در آنها هيدروليز شده است بي رنگ مانده و نقاطي كه نشاسته در آن هيدروليز نشده به رنگ قرمز قهوهاي مايل به بنفش در ميآيد .

10 ـ 5 ـ شير ليتموس ²⁵ ( ليتموس = تورنسل = جوهر آفتابگردان )

اين آزمايش براي شناسائي ميكروارگانيسمهايي كه قادر به منعقد كردن شير و احياي ليتموس ( تورنسل ) هستند به كار ميرود .

10 ـ 5 ـ 1 ـ دستور كار ـ باكتري را در محيط شير ليتموس كشت داده و مدت 2 الي 5 روز در گرمخانه قرار دهيد . كشتها را روزانه مورد بررسي قرار دهيد .

10 ـ 5 ـ 2 ـ نتيجه آزمايش ـ آزمايش انعقاد زماني مثبت است كه شير لخته گردد و احياي تورنسل توسط ميكروارگانيسم در صورتي مثبت است كه رنگ آبي ليتموس زايل گردد .

10 ـ 6 ـ توليد اسيد در شير برم كرزول

با استفاده از معرف بنفش برم كرزول ميتوان شدت توليد اسيد را كه در اثر تخمير لاكتوز شير ايجاد ميگردد تعيين كرد .

10 ـ 6 ـ 1 ـ نتيجه آزمايش : در جدول زير نشان داده شده است .

10 ـ 7 ـ احيأ نيترات ²⁶

اين آزمايش براي شناسائي ميكروارگانيسمهايي كه قادر به احيأ نيترات و توليد نيتريت هستند به كار ميرود .

10 ـ 7 ـ 1 ـ دستور كار ـ ميكروارگانيسم مورد نظر را در آبگوشت غذائي داراي يك درصد نيترات پتاسيم كشت داده و مدت 2 تا 5 روز در گرمخانه قرار دهيد . سپس يك ميلي ليتر از محيط كشت را به يك لوله آزمايش انتقال داده و به آن يك ميلي ليتر از محلول ( الف ) و يك ميلي ليتر از محلول ( ب ) معرف گريس به آن بيفزائيد ( طرز تهيه اين معرف آخر استاندارد ذكر شده است ) پيدايش رنگ نارنجي , صورتي مايل به قهوهاي پس از چند دقيقه در دماي آزمايشگاه دليل وجود نيتريت در محيط كشت ميباشد .

در صورت منفي بودن آزمايش از معرف پودر روي به لوله آزمايش بيفزائيد . پيدايش رنگ نارنجي مايل به صورتي در مدت چند دقيقه در دماي آزمايشگاه دليل وجود نيترات احيأ نشده در محيط كشت ميباشد .

10 ـ 8 ـ ذوب ژلاتين ²⁷

اين آزمايش به منظور شناسائي ميكروارگانيسمهايي كه قادر به ذوب ژلاتين هستند به كار ميرود .

10 ـ 8 ـ 1 ـ دستور كار ـ ميكروارگانيسم را در محيط ژلاتين به طور عمقي كشت داده و در دماي مناسب قرار دهيد .

در صورت عدم ذوب ژلاتين تا 14 روز لولهها را مورد بررسي قرار دهيد . حالت ذوب ژلاتين براي شناسائي برخي از باكتريها ويژگي بسيار مهمي است از اين رو محيط كشت حتمأ بايد در دماي كمتر از 20 درجه سلسيوس قرار گيرد تا از ذوب ژلاتين در اثر حرارت جلوگيري شود لولههاي آزمايش بايد در فواصل 24 ساعته بازديد شوند .

يادآوري ـ در مواردي كه شكل و حالت ذوب شدن ژلاتين از نظر شناسائي باكتري اهميتي ندارد ميتوان لولهها را در دماي دلخواه ميكروارگانيسم مورد آزمايش قرار داد و قبل از بررسي نتيجه آزمايش ( ذوب شدن ) آن را در يخچال گذارده و سپس بررسي كنيد .

10 ـ 9 ـ توليد اندل

اين آزمايش به منظور تشخيص بعضي از باكتريها است كه از اسيد آمينه , تريپتوفان و اندل توليد ميكنند .

10 ـ 9 ـ 1 ـ دستور كار ـ ميكروارگانيسم را در آب پيتنه و يا آب تريپتنه كشت داده , ( پيتن موجود در محيط حتمأ بايد داراي تريپتوفان بوده و محيط عاري از اندول و گلوكز باشد ) و مدت 2 تا 5 روز در گرمخانه قرار دهيد . پس از اين مدت يك ميلي ليتر اتر يا گزيلن به محيط افزوده و كاملا تكان دهيد سپس لوله را در جا لولهاي قرار داده تا اتر يا گزيلن كاملا در سطح قرار گيرد . آنگاه از كناره لوله آزمايش و بدون تكان دادن آن , يك ميلي ليتر از محلول ( الف ) ارليخ و سپس يك ميلي ليتر محلول ارليخ ( ب ) به آن بيفزائيد .

( طرز تهيه معرف ارليخ A و B آخر استاندارد ذكر شده است )

10 ـ 9 ـ 2 ـ نتيجه آزمايش ـ تشكيل حلقه صورتي رنگ نتيجه وجود اندل و مثبت بودن آزمايش است .

10 ـ 10 ـ توليد هيدروژن سولفوره H₂S

اين آزمايش به منظور شناسائي وجود ( H₂S ) در محيط استات سرب كه توسط برخي از ميكروارگانيسمها توليد ميشود انجام ميگيرد .

10 ـ 10 ـ 1 ـ دستور كار ـ ميكروارگانيسم مورد نظر را در محيط استات سرب به طور عمقي كشت داده و به مدت 5 روز در اتو قرار دهيد .

( يا از محيط عصاره گوشت استفاده شود كه در اين صورت در زير سرپوش باريكهاي از كاغذ صافي خيس خورده در استات سرب 10 درصد را كه خشك شده قرار دهيد و بعد از 2 الي 4 روز گرمخانه گذاري بررسي كنيد

10 ـ 10 ـ 2 ـ نتيجه آزمايش ـ در مورد استفاده از محيط استات سرب رنگ قهوهاي يا سياه نشان دهنده H₂S در محيط ميباشد كه معمولا با توليد گاز در محيط همراه است .

در مورد استفاده از محيط عصاره گوشت باريكه صافي به رنگ سياه يا قهوهاي در ميآيد .

10 ـ 11 ـ توليد اوره آز

اين آزمايش به منظور تشخيص آنزيم اوره آز در محيط توسط برخي از ميكروارگانيسمها ميباشد .

10 ـ 11 ـ 1 ـ دستور كار ـ ميكروارگانيسم را در محيط اوره به طور عمقي كشت داده و حداكثر تا 5 روز بعد از گرمخانه گذاري بررسي كنيد . ( محيط كشت بايد معرف فنل رد نيز داشته باشد .)

10 ـ 11 ـ 2 ـ نتيجه آزمايش ـ رنگ اصلي محيط به علت اسيدي بودن آن زرد است . ولي به سبب تشكيل آنزيم اوره آز و تجزيه اوره در محيط قليائي به رنگ صورتي در ميآيد .

10 ـ 12 ـ توليد كاتالاز

اين آزمايش براي شناسائي آنزيم كاتالاز كه توسط برخي از ميكروارگانيسمها در محيط توليد ميشود انجام ميگيرد .

10 ـ 12 ـ 1 ـ دستور كار ـ به كشت 24 ساعته ( مايع ) و يا پرگنه ميكروارگانيسم مورد نظر در محيط جامد چند قطره آب اكسيژنه 10 حجمي بيفزائيد .

10 ـ 12 ـ 2 ـ نتيجه آزمايش ـ توليد حبابهاي اكسيژن نشان دهنده آنزيم كاتالاز در محيط و تجزيه آب اكسيژنه ميباشد .

10 ـ 13 ـ رشد در محيط سيترات

اين آزمايش , به منظور شناسائي ميكروارگانيسمهايي كه قادر به استفاده از سيترات به عنوان تنها منبع كربن هستند , به كار ميرود .

10 ـ 13 ـ 1 ـ دستور كار ـ ميكروارگانيسم را توسط سوزن كشت برداشت و در محيط سيترات كشت دهيد چون در صورت استفاده از حلقه كشت ( لوپ ) مقداري از محيط كشت قبلي داراي قند , وارد محيط سيترات ميشود .

10 ـ 13 ـ 2 ـ نتيجه آزمايش ـ مثبت بودن آزمايش با رشد ميكروارگانيسم در محيط كه همراه با تيرگي ( كدورت و تغيير رنگ است مشخص ميشود .)

11 ـ حركت

اين آزمايش براي شناسائي حركت در ميكروارگانيسمها به كار ميرود . از پرگنههاي مورد آزمايش به وسيله سوزن كشت مستقيم ( آنس ) برداشت كرده و در لوله آزمايش محتوي محيط سيم (Sim Medium) به طور مستقيم فرو كنيد . ( طرز تهيه محيط سيم در آخر استاندارد ذكر شده است .) در صورت متحرك بودن باكتري محل فرو رفتن سوزن كشت به صورت منطقه كدر و پخش شدهاي ديده ميشود .

پيوست

1 ـ معرف باريتر (Reagenf 'Barrits)

اين معرف , محلول 5 درصد آلفا نفتول در الكل اتيليك مطلق ميباشد .

2 ـ معرف گريس ايلوسواي (s'Grless l losvay )

2 ـ 1 ـ معرف الف ـ يك گرم اسيد سولفانيليك را در 125 ميلي ليتر اسيد استيك 5 نرمال حل كنيد .

2 ـ 2 ـ معرف ب ـ نيم گرم آلفانفتيل آمين را در 100 ميلي ليتر اسيد استيك حل كنيد .

2 ـ 3 ـ طرز تهيه اسيد استيك 5 نرمال ـ 28/75 ميلي ليتر اسيد استيك كلاسيال را به 71/25 ميلي ليتر آب مقطر بيفزائيد .

3 ـ معرف ارليخ

3 ـ 1 ـ معرف ارليخ الف ـ چهار گرم پارادي متيل آمينوبنزآلدئيد را در مخلوطي از 380 ميلي ليتر الكل 96 درجه و 80 ميلي ليتر اسيد كلرئيدريك غليظ حل كنيد .

3 ـ 2 ـ معرف ب ـ محلول اشباع شده پرسولفات پتاسيم در آب ميباشد .

4 ـ محيط سيم (SIM Medlum)

الف ـ تركيب محيط :

20 گرم	Trypticase peptone	تريپتكازيپتن ( پپتن كازئين )
6/1 گرم	Thiotone	تيوتون ( پپتن گوشت )
0/2 گرم	Sodium thlosulphate	تيوسولفات سديم
0/2 گرم	Ferrous ammonium citrate	سيترات آمونيوم فرو
3/5 گرم	Agar	آگار

ب ـ طرز تهيه : مواد ??? را به يك ليتر آب مقطر بيفزائيد . به منظور حل شدن كامل آن را حرارت داده تا به جوش آيد پس از سرد شدن تا 50 الي 60 درجه سانتيگراد PH را در 7/4±0/2 تنظيم كنيد . سپس در حجمهاي 5 تا 7 ميلي ليتري در لولههاي كشت تقسيم كنيد . سپس در 121 درجه سلسيوس براي 15 دقيقه سترون كنيد .

محيط سيم به صورت آماده در دسترس ميباشد . در صورت استفاده از آن طبق دستور مربوطه عمل شود .

1- STOMACHER

2- Broth Cultures

3- Agar Cultures

4- Stab Cultures

5- Shake Cultures

6- Slant (slope) Cultures

7- Selective

8- Enrichment

9- Differential

10- Aseptic Technlque

11- در مورد سترون كردن سوزن كشت , گروهي از ميكرب شناسان عمودي گرفتن آن را روي شعله و عدهاي ديگر كج گرفتن آن را با زاويه 45 درجه توصيه ميكنند .

12- صافيهاي ميلي پور با منافذي به قطر 0/43 الي 0/47 ميكرن كه با حرف HA مشخص شدهاند . صافيهاي اكسوئيد با منافذي به قطر 0/5 تا 1 ميكرن

13- Circular

14- IRREGULAR

15- RHIZOID

16- Crystal Violet ( Gentian violet )

17- Loeffler 's Methylene Blue

18- Gram ' s Staining Method

19- Ziehl - Neelsen

20- Carbohydrate Fermentation

21- Methyl red

22- voges - Proskauer

23- Rarrit 's Reagent

24- Starch Hydrolysis

25- Litmus Milk

26- Nitrate Reduction

27- Gelatin Liquification

ISLAMIC REPUBLIC OF IRAN

Institute of Standards and Industrial Research of Iran

ISIRI NUMBER

2325

A guideline for general methods practiced in food microbiology laboratories

7^th Edition